Category Archives: 실험실 노트

[실험실 노트] Organoid의 기본 개념과 활용

최근에 진행 중인 연구 중에 Organoid modeling을 하면 좋을 것 같은 결과를 얻어서, Organoid에 대해서 공부한 내용들을 간단하게 정리할까 합니다. 3D culture 또는 Organoid에 대해서는 이쪽 분야만 전문적으로 연구하시는 분들도 많지만, 이제는 저 같은 일반 연구자들도 Cell culture와 같이 하나의 연구 방법론으로 많이 사용하는 시대가 온 것 같습니다. 그만큼 일반적인 Cell culture로는 한계가 있던 것을, Organoid를 이용하면 좀 더 인체와

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[실험실 노트] Multi-cistronic vector design: IRES와 2A peptide

플라스미드를 이용하여, 원하는 유전자를 세포에서 단백질로 발현시키려고 하다보면 종종 동시에 다양한 마커가 필요하게 됩니다. 원하는 세포만 Selection 하기 위한 항생제 내성 유전자를 도입한다던지, 형광 현미경에서 유전자가 들어간 세포만 골라보기 위해서 형광 단백질을 동시에 발현시킨다던지 하는 경우가 말이죠. 저도 최근에 이러한 목적으로 실험 디자인과 문헌을 찾다보니, 어렴풋이 알고 있던 IRES와 2A sequence에 대해서 공부하게 되어서, 관련 내용을 정리해보려고 합니다. Cistron은 Gene

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[실험실 노트] CRISPR-Cas9 절단 효율 검출

앞선 포스팅에서 CRISPR-Cas9의 개념과 실험 디자인에 대해서 소개하였는데, 실제 디자인한 guideRNA의 절단 효율을 확인하는 방법에 대해서 정리해 보고자 합니다. 관련포스팅 보기> [실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing 일반적으로 sgRNA의 target site 절단 효율은 mismatch cleavage enzyme을 이용하여, indel이 발생한 위치를 찾아 자르고 gel loading을 해서 band를 통해 확인하는 방법을 이용합니다. 아래 그림과 같이 Cas9 단백이 작동해서, indel을 발생시켰다면

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[실험실 노트] Real Time-PCR의 원리와 qPCR primer를 이용한 CNV 확인

오늘은 RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 기본적인 원리와 실험적으로 이용하기 위한 resource들을 정리하는 포스팅을 남기고자 합니다.   I. Realtime-PCR과 PCR의 차이 Realtime PCR (RT-PCR)은 그 이름에서 알 수 있듯이, 실시간 (Real-Time)으로 증폭 산물 (PCR product)을 Monitoring 한다는 것이 PCR과 가장 큰 차이입니다. 일반적으로 RT-PCR은 정량 (Quantitation)이 가능하기 때문에 qPCR이라고도 합니다. RT-PCR은 일반적으로 RNA에서 cDNA를 만든 후에 PCR을 진행하는 Reverse-Transcription PCR을

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[실험실 노트] Lentivirus의 특성 및 연구 활용

최근에 관심이 있는 유전자를 Knock-out 시킨 세포주를 이용하여 실험을 하려고, CRISPR-Cas9 system을 이용한 Knock-out stable cell line을 제작하고 있습니다. 이전에 포스팅한대로, sgRNA를 디자인하고 제작한 벡터를 만들면 다음 단계로는 해당 유전자를 세포주의 유전체에 끼워 넣어야 하는데, 이때 Lentivirus를 이용하게 됩니다. 그래서 이번 포스팅에서는 Lentivirus를 이용하여 유전체를 전달하는 과정과 관련된 배경 지식들을 정리해보고자 합니다. 관련 포스팅 보기> [실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을

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[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

최근에는 유전자 가위 기술이 워낙 보편화되어서, 일반 연구자들도 실험을 할 때 특정 유전자를 Knock-Out 시키기위해서 CRISPR/Cas9을 많이 이용하는 것 같습니다. 저도 최근에 특정 유전자의 기능을 연구하면서, 해당 유전자를 Knock-Out 시키기 위해서CRISPR/Cas9을 이용하려고 하다보니, 해당 메커니즘이나 원리를 제대로 한번 정리해볼 필요가 있다는 생각이 들었습니다. 그래서 이번 포스팅은 흔히 유전자 가위라고 불리는 CRISPR/Cas9 의 작동 원리와 해당 원리를 이용한 타겟 유전자 편집에

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유전자 변형 마우스 제작과 기본 개념

유전체 연구를 하다보면, 많은 후보 유전자들의 이상을 발견하게 되고 실제 질병 발생 메커니즘을 재현하기 위해서 mouse를 모델로 선택하게 됩니다. 사람과 mouse는 99%의 유전체가 동일하고, 다양한 장점 (다루기 쉽고, 세대가 짧고, 저렴하여 실험이 용이) 때문에 유전체 이상에 의한 질병 발생의 동물로 많이 이용하게 됩니다. 이번 포스팅에서는 mouse를 이용한 유전자 이상 동물 모델을 재현하기 위해 필요한 유전자 변형 마우스 (Genetically-Engineered mouse; GEM)와

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[실험실 노트] Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved!

PCR 실험 도중 유용한 글이 있어 스크랩한다. Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved! No, it isn’t you that’s the problem, and you’re certainly not alone if you’re having trouble amplifying GC-rich sequence and/or understanding why GC-rich sequences are causing such problems in the first place! Amplification of GC-rich sequences by PCR has been an irritant for scientists for decades! When

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[실험실 노트] Sanger sequencing Primer design

최근 시퀀싱 검사의 대세는 NGS 이지만, 여전히 논문을 위한 논문에서는 Gold standard인 Sanger 시퀀싱 결과를 Supple data로 요구하고 있다. 이번에 유전자 30개 정도되는 NGS 패널을 디자인하고, 검출된 변이로 Sanger 시퀀싱 확인 및 가족 검사 까지 진행하고 있는데, M모 업체를 통해 견적을 받아보니 타겟 위치 셋업 비용 10만원 + 검체 추가당 3만원 + Blood에서 DNA 추출 검체당 3만원을 달란다. 의뢰할 검체가

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[스크랩] PCR에서 GC enhancer의 역할

PCR 관련 제품 제조회사에서 GC enhancer, band helper 등등으로 판매하는 제품이 어떠한 원리로 작동하는지 검색하다가 유용한 답변이 있어, 스크랩한다. 해당 solution에는 betaine과 비슷한 물질이 포함되어 있는데, 이 물질은 AT의 이중 수소 결합과 GC의 삼중 수소 결합에 영향을 미치고, 결론적으로 GC 결합의 안정도를 AT 결합보다 더 떨어뜨려 AT와 GC의 안정도의 차이를 줄여주는 효과를 일으킴으로써 GC content의 차이에 의해서 PCR이 영향을 받는

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